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          小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒样本处理及要求分析说明讨论
          点击次数:120 发布时间:2019-01-17
             小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人可溶性核因子κB受体活化因子配基水平。用纯化的人可溶性核因子κB受体活化因子配基抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入类可溶性核因子κB受体活化因子配基,再与HRP标记的类可溶性核因子κB受体活化因子配基抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
           
            小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的类可溶性核因子κB受体活化因子配基呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人可溶性核因子κB受体活化因子配基浓度。
           
            小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒样本处理及要求:
           
            1、血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
           
            2、血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
           
            尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
           
            组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
           
            1、准备:从冰箱取出小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒,室温复温平衡30分钟。
           
            2、配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
           
            3、加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
           
            4、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
           
            5、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
           
            6、加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50μL,空白对照孔不加。
           
            7、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
           
            8、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
           
            9、显色:每孔先加入显色剂A液50μL,再加入显色剂B液 50μL,平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s),37℃避光显色15min。
           
            10、终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。
           
            11、测定:以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。
           
            12、小鼠核因子κB受体活化因子配基试剂盒计算:根据标准品的浓度及对应的OD值,计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的OD值,在回归方程上计算出对应的样品浓度,也可以使用各种应用软件来计算,zui终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
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